Microscopios estéreo son a menudo apodados caballo de batalla de laboratorio o el departamento de producción. Los usuarios pasan muchas horas detrás de la inspección ocular, observando, documentando o disecando muestras. ¿Qué factores deben tenerse en cuenta al seleccionar un microscopio estéreo? La respuesta es, depende». ¿Por qué es eso? Porque depende de la aplicación, de la tarea que el usuario quiere lograr. Básicamente, un microscopio estéreo es una herramienta para ampliar un objeto tridimensional en tres dimensiones. A diferencia de un microscopio compuesto, un microscopio estéreo es capaz de hacer frente a esta tarea.
Principios de Greenough y Cycloptic
Los microscopios binoculares de los viejos tiempos presentaban un sistema de lentes simple y el mismo diseño que los microscopios compuestos tradicionales. Estos microscopios de disección, como entonces se conocían, se usaron principalmente en biología con fines de disección; No había aplicaciones técnicas para ellos en ese momento. Alrededor de 1890, el biólogo y zoólogo estadounidense Horatio S. Greenough introdujo un principio de diseño que sigue siendo utilizado hoy por todos los principales fabricantes de instrumentos ópticos. Microscopios estéreo basados en el «principio de Greenough» ofrecen imágenes estereoscópicas genuinas de muy alta calidad.
En 1957 la compañía óptica americana introdujo el diseño moderno del microscopio estéreo con un objetivo principal compartido y lo llamó Cycloptic. Su caja de aluminio moderna contenía dos trayectorias paralelas del haz y el objetivo principal, así como un cambiador de la ampliación de cinco pasos. Este tipo de microscopio estereoscópico, que se basaba en el telescopio o en el principio CMO (Common Main Objective), se adoptó además del tipo Greenough por todos los fabricantes y se utilizó para instrumentos modulares de alto rendimiento. Dos años más tarde, otra compañía estadounidense, Bausch & Lomb, presentó su diseño StereoZoom® Greenough con una innovación innovadora: un cambiador de aumento continuo (zoom). Casi todos los diseños actuales se basan en un sistema de zoom.
Figura. 2a, b (derecha): Dos principios básicos del microscopio estéreo. A: el principio del telescopio o CMO b: el principio de Greenough
Criterios para seleccionar un microscopio estéreo
Los microscopios estéreos todavía se basan en los enfoques técnicos mencionados – el principio de Greenough o CMO – hoy en día. ¿Qué otros factores deben ser considerados? Hay cuatro cosas que deben evaluarse cuidadosamente:
- A) ¿Cuál es la aplicación?
- B) ¿Qué estructuras deben ser observadas, documentadas o visualizadas?
- C) ¿Cuántas personas están usando el microscopio?
- D) ¿Cuál es el presupuesto disponible para la solución?
Una vez conocidos los factores anteriores, se reduce a los siguientes criterios:
- Ampliación, rango de zoom y campo de objeto
- Profundidad de campo y apertura numérica
- Calidad óptica y distancia de trabajo
- Ergonomía
- Iluminación
Ampliación, rango de zoom y campo de objeto
La ampliación total de los microscopios estéreo es la ampliación combinada del cambiador de aumento, el objetivo y los oculares.
El cambiador de aumento o el cuerpo del zoom
Como una lupa, el cambiador de la ampliación consiste en las lentes ópticas que se pueden utilizar para cambiar la ampliación del instrumento. Cambiar la posición del cambiador de aumento cambia el grado en el que se agranda la imagen. El grado en el que se magnifica la imagen se denomina factor de ampliación. Los modernos microscopios estereofónicos son capaces de proporcionar una ampliación de hasta 16x (sólo zoom cuerpo) con un rango de zoom de 20.5: 1 y característica motorización o codificación para permitir mediciones fiables.
A continuación, la imagen es ampliada aún más por los oculares. Para averiguar la magnificación del objeto que está observando en los oculares, el usuario tiene que multiplicar los factores de aumento del cambiador de aumento y los oculares.
Sin embargo, en aras de la integridad, aquí está la fórmula:
MTOT VIS es la magnificación total que queremos calcular. VIS significa «visual».
Z es el nivel del cambiador de aumento.
ME es la ampliación del ocular.
MO es la ampliación del objetivo principal (1x en caso de que no se utilice lente suplementaria en un sistema Greenough)
Campo del objeto
Al mirar los oculares desde la distancia adecuada y con la distancia interpupilar establecida correctamente, se ve un área circular llamada el campo del objeto. El diámetro del campo del objeto cambia dependiendo de la magnificación. En otras palabras, existe una relación matemática entre la ampliación y el diámetro del campo del objeto. Los oculares con una ampliación de 10x proporcionan un número de campo de 23. Esto significa que con una ampliación de 1x del cuerpo del zoom y el objetivo principal el campo del objeto es de 23 mm de tamaño. Con un aumento de 3 veces, el campo objeto se reduce a un tercio, es decir, el campo objeto tiene un diámetro de sólo 7,66 mm.
Profundidad de campo y apertura numérica
En microscopía, la profundidad de campo se ve a menudo como un parámetro empírico. En la práctica se determina por la correlación entre la apertura numérica, la resolución y la ampliación. Para la mejor impresión visual posible, las facilidades de ajuste de los microscopios modernos producen un equilibrio óptimo entre la profundidad de campo y la resolución – dos parámetros que en teoría están inversamente correlacionados. Valores prácticos para la profundidad de campo visual El autor de la primera publicación sobre el tema de la profundidad de campo visiblemente experimentada fue Max Berek, que publicó los resultados de sus extensos experimentos ya en 1927. La fórmula de Berek da valores prácticos para la profundidad visual de campo y por lo tanto todavía se utiliza hoy en día. En su forma simplificada, es la siguiente:
Si en la ecuación anterior la magnificación visual total se substituye por la relación de aumento útil (MTOT VIS = 500 a 1.000 x NA), se puede ver que, una aproximación primera, la profundidad de campo es inversamente proporcional al cuadrado de La apertura Numérica
Particularmente a bajas ampliaciones, la profundidad de campo puede aumentarse significativamente deteniéndose, es decir reduciendo la abertura numérica. Esto se hace normalmente con el diafragma de la abertura o un diafragma en un plano conjugado. Sin embargo, cuanto menor sea la apertura numérica, menor será la resolución lateral.
Por lo tanto, es una cuestión de encontrar el equilibrio óptimo de resolución y profundidad de campo dependiendo de la estructura del objeto. En el caso de los microscopios estéreo, a menudo es necesario hacer un cierto compromiso a favor de una mayor profundidad de campo, como la dimensión z de las estructuras tridimensionales lo exige con frecuencia.
Aún más profundidad de campo – FusionOpticsTM
Un enfoque óptico sofisticado que cancela la correlación entre la resolución y la profundidad de campo en los microscopios estéreo es FusionOptics ™. Aquí, uno de los caminos de luz proporciona un ojo del observador con una imagen de alta resolución y baja profundidad de campo. A través del segundo camino de luz, el otro ojo ve una imagen del mismo objeto con baja resolución y alta profundidad de campo. El cerebro humano combina las dos imágenes separadas en una imagen global óptima que cuenta con alta resolución y alta profundidad de campo.
Otro ejemplo que ilustra las capacidades fenomenales del cerebro humano es el microscopio estéreo de Greenough. En este caso, los planos de objetos de las trayectorias de luz izquierda y derecha están en un ligero ángulo entre sí. En la imagen global, toda el área sombreada parece estar muy enfocada, aunque no ocurre tanto en la imagen izquierda como en la derecha.
Calidad óptica
La calidad óptica para los microscopios estereoscópicos se clasifica generalmente como Achro o Achromat (acromático), y como Apo (apochromatic) para el grado más alto de la corrección para las aberraciones esféricas y cromáticas. Las correcciones de curvatura de campo son Plan abreviado Plan, mientras que PlanApo designa una combinación de aberración cromática y corrección de curvatura de campo.
¿Qué es una aberración cromática?
En instrumentos ópticos como los microscopios estereoscópicos, una aberración cromática es un tipo de distorsión en el que hay un fallo de una lente para enfocar todos los colores al mismo punto de convergencia. Se produce porque las lentes tienen un índice de refracción diferente para diferentes longitudes de onda de la luz (la dispersión de la lente). El índice de refracción disminuye con el aumento de la longitud de onda. El objetivo de un buen diseño óptico es reducir o eliminar completamente este efecto.
Una lente acromática o achromat es una lente que está diseñada para limitar los efectos de la aberración cromática y esférica. Las lentes acromáticas son corregidas para traer dos longitudes de onda (típicamente rojo y azul) en foco en el mismo plano. Estos tipos de lentes o microscopios se utilizan para tareas en las que no es imprescindible la reproducción del color y se evalúan principalmente las características geométricas. Las lentes apocromáticas, por otra parte, están diseñadas para corregir tres longitudes de onda (rojo, verde y azul) y ponerlas en foco en el mismo plano.
Distancia de trabajo
Esta es la distancia entre la lente frontal del objetivo y la parte superior de la muestra cuando la muestra está enfocada. En la mayoría de los casos, la distancia de trabajo de un objetivo disminuye a medida que aumenta la ampliación. En microscopía estéreo, la distancia de trabajo es uno de los criterios más importantes, ya que tiene un impacto directo en la usabilidad del microscopio como herramienta.
Ergonomía – la gente es muy diferente
Hay personas altas y cortas y esto hace que los requisitos del instrumento sean un asunto personal. Por ejemplo, la altura existente de un microscopio equipado para una determinada tarea con accesorios y con una distancia de trabajo particular puede ser bastante inadecuada para el usuario específico. Si la altura de visualización es demasiado baja, el observador se verá obligado a doblarse hacia delante mientras trabaja, lo que dará lugar a una tensión muscular en la región del cuello. Idealmente, por lo tanto, la altura de visión y el ángulo de visión del microscopio debe ser ajustable a la construcción del usuario. Además, una altura de visualización variable es la mejor manera de prevenir una postura totalmente sedentaria. Permite al observador adoptar una postura personal de sentarse y cambiarla periódicamente de acuerdo con la necesidad natural de desplazarse de vez en cuando. Es cierto que la altura de la silla puede ser alterada para que una postura relajada, ligeramente doblada se sustituye por la anterior rígidamente erguida, pero este no es el mejor enfoque. Es mucho más simple y más cómodo usar un tubo binocular variable para compensar la diferencia de altura.
Gracias al enfoque de producto modular, los microscopios estéreo con un diseño CMO ofrecen muchas maneras de adaptar el instrumento al tamaño del usuario o los hábitos de trabajo y por lo tanto son la solución preferida.
Iluminación
En la microscopía estéreo, la iluminación es la clave que llevará todo el trabajo a la luz. La iluminación correcta permitirá visualizar las estructuras requeridas o tal vez nueva información sobre una muestra que se descubrirá, simplemente cambiando el tipo de luz. Es importante que la iluminación coincida correctamente con el microscopio correcto y la aplicación correcta.
Tipos de iluminación
Incidente
La luz incidente se utiliza principalmente con especímenes no transparentes. El método de suministro de esta luz (luz de anillo, manchas, etc.) dependerá de la textura de la muestra y de los requisitos de la aplicación. Se necesita luz incidente para todo tipo de especímenes no transparentes. Dependiendo de la textura de una muestra y el objetivo de los resultados, una selección ecléctica de soluciones de iluminación incidente está disponible.
Luz transmitida
La luz transmitida es deseable para diversos tipos de especímenes transparentes que van desde muestras biológicas tales como organismos modelo a polímeros.
Iluminación de campo claro transmitida estándar
La iluminación de campo claro transmitida estándar se utiliza para todo tipo de especímenes transparentes con alto contraste y suficiente información de color.
Iluminación oblicua transmitida
Esta técnica de iluminación se utiliza para muestras que son casi transparentes e incoloras. Debido a la posición oblicua de la iluminación se puede lograr un mayor contraste y claridad visual de la muestra.
Iluminación de campo oscuro
La observación de campo oscuro en estereomicroscopia requiere un soporte especializado que contenga un espejo de reflexión y una placa de protección contra la luz para dirigir un cono hueco invertido de iluminación hacia la muestra en ángulos oblicuos. Los elementos principales de la iluminación de campo oscuro son los mismos tanto para los estereomicroscopios como para los microscopios compuestos más convencionales, que a menudo están equipados con sistemas complejos de condensadores multi-lente o condensadores que tienen espejos internos especializados que contienen superficies reflectantes orientadas a geometrías específicas.
Método de contraste para especímenes claros y transparentes
Rottermann Contrast ™ es una técnica de iluminación parcial que muestra los cambios del índice de refracción como diferencias de brillo. Las estructuras de la fase entonces aparecen típicamente como imágenes espaciales del tipo del alivio como colinas en contraste positivo del alivio y como hendiduras en contraste invertido del alivio. Esta técnica ofrece muchas vistas variables para extraer la máxima cantidad posible de información.
Conclusión
Evaluación cuidadosa de los requisitos de aplicación para el microscopio estéreo es el elemento clave para la satisfacción duradera del usuario. Dado que es el caballo de batalla del laboratorio o del departamento de producción, quienes tomen las decisiones deben asegurarse de que son capaces de adaptar el instrumento 100% a las necesidades de los usuarios. Esto requiere un proveedor de soluciones de microscopía que sea capaz de hacer frente a este exigente requisito.
