La fluorescencia es un efecto que fue descrito por George Gabriel Stokes en 1852. Observó que la fluorita empieza a brillar después de ser iluminada con luz ultravioleta. La fluorescencia es una forma de fotoluminiscencia que describe la emisión de fotones por un material después de ser iluminado con luz. La luz emitida es de longitud de onda más larga que la luz excitante. Este efecto se llama el cambio de Stokes.

Fluorescencia como herramienta en microscopia

La fluorescencia es ampliamente utilizada en microscopía y una herramienta importante para observar la distribución de moléculas específicas. La mayoría de las moléculas en las células no fluorescen. Por lo tanto, tienen que ser marcados con moléculas fluorescentes llamados fluorocromos. Las moléculas de interés se pueden marcar directamente, (por ejemplo, ADN con DAPI) o pueden inmunomarcarse con fluorocromos que están acoplados a anticuerpos específicos. La fijación de las células suele ser necesaria para la inmunotinción.

La microscopía de fluorescencia también permite imágenes de lapso de tiempo de células vivas o tejidos. Para este propósito las proteínas de interés pueden ser marcadas con moléculas fluorescentes codificadas genéticamente como GFP (proteína fluorescente verde). Las moléculas de interés (por ejemplo, Ca ^ {2+}) también se pueden marcar usando colorantes sintéticos de unión reversible (por ejemplo, fura – 2) o proteínas de origen natural genéticamente modificadas (por ejemplo, derivados de GFP).

Los cambios en los estados de energía de los electrones conducen a la luminiscencia

 La luminiscencia describe la ocurrencia de efectos luminosos que son causados ​​por el cambio de un electrón de un estado excitado a un estado con energía más baja. Los electrones pueden existir en diferentes estados de energía. El estado fundamental es un estado muy estable para un electrón y tiene el nivel de energía más bajo. Si los electrones absorben energía, pueden elevarse a un nivel de energía superior, un estado excitado. Como el estado excitado es de mayor energía que el estado fundamental, la energía tiene que ser liberada cuando un electrón vuelve a su estado fundamental. Esta energía puede liberarse en forma de fotones emitidos. Existen varias formas de luminiscencia que difieren en la forma en que el sistema se excita, p. En la electroluminiscencia el sistema se excita a través de una corriente eléctrica, la quimioluminiscencia se produce debido a una reacción química y la fotoluminiscencia resulta de la excitación a través de fotones. La fotoluminiscencia puede dividirse además en dos subgrupos, fluorescencia y fosforescencia. La principal diferencia entre la fluorescencia y la fosforescencia es la duración de su luminiscencia. La fluorescencia termina inmediatamente cuando se detiene la iluminación. En contraste, la fosforescencia puede durar horas después de que la excitación haya terminado.

Fig.1: Cuando la luz de una determinada longitud de onda (longitud de onda de excitación) golpea una molécula (por ejemplo, en un fluoróforo) los fotones son absorbidos por electrones de la molécula. Los electrones son entonces elevados de su estado fundamental (S0) a un nivel de energía más alto, el estado excitado (S1 ‘). Este proceso se denomina excitación (1). La vida útil del estado excitado es corta (típicamente 10-9 / -10-8 segundos) y parte de la energía del electrón se pierde durante ese tiempo (2). Cuando los electrones abandonan el estado excitado (S1) y regresan al estado del suelo (3), pierden la energía restante absorbida durante la excitación. En el caso de los fluoróforos, la energía se emite como luz (emisión de fluorescencia) de una longitud de onda más larga con (y por lo tanto con menos energía) que la luz de excitación. Este fenómeno se llama cambio de Stokes.

El mecanismo de fluorescencia 

Los fluorocromos sólo se fluorescen si se iluminan con luz de la longitud de onda correspondiente. La longitud de onda depende del espectro de absorción del fluoróforo y debe garantizarse que se suministre una cantidad apropiada de energía para elevar los electrones al estado excitado. Después de que los electrones son excitados pueden permanecer en este estado de alta energía durante un tiempo muy corto solamente. Cuando los electrones se relajan a su estado fundamental u otro estado con un nivel de energía más bajo, la energía se libera como un fotón. Como parte de la energía se pierde durante este proceso, la luz con una mayor longitud de onda y menor energía es emitida por el fluorocromo en comparación con la luz absorbida.

El mecanismo de fosforescencia

Como las moléculas fosforescentes pueden luminescerse durante mucho más tiempo que los fluorocromos, debe haber una diferencia en la forma en que almacenan la energía de excitación. La base de esta discrepancia se encuentra en las dos formas de niveles de excitación, el estado excitado singlete y el estado excitado triplete, que se basan en diferentes alineaciones de espín.

Las rotaciones son un atributo de los electrones. En términos simplificados, el spin describe el momento angular del electrón causado por su rotación. La orientación del spin de un electrón puede ser positiva (+1/2) o negativa (-1/2). Los pares de spin de niveles de energía más altos pueden ser paralelos o antiparalelos en su orientación entre sí. En los pares de giros antiparalelos, los momentos angulares individuales se compensan entre sí y el giro total obtiene un valor de cero. Esta alineación de spin se denomina estado singlete. Dos giros paralelos no compensan y obtienen un valor diferente de cero. En este caso se dice que los giros están en un estado triplete.

La fluorescencia ocurre cuando los electrones vuelven de un estado excitado singlete al estado fundamental. Pero en algunas moléculas los giros de los electrones excitados pueden ser conmutados a un estado triplete en un proceso llamado cruzamiento entre sistemas. Estos electrones pierden energía hasta que se encuentran en estado triplete. Este estado es de mayor energía que el estado fundamental pero también de menor energía que el estado excitado singlete. Por lo tanto, los electrones no pueden volver al estado singlete, ni pueden regresar fácilmente al estado fundamental, ya que sólo se permiten giros totales con un valor cero debido a la mecánica cuántica. Por lo tanto, las moléculas quedan atrapadas en su estado energético.

Sin embargo, son posibles unos pocos cambios desde el estado base triplete hasta el estado fundamental a la vez. Estos cambios dan lugar a la emisión de fotones y la fosforescencia. Puesto que sólo son posibles unos pocos eventos a la vez, el estado de tierra triplete presenta un tipo de depósito de energía, haciendo posible la fosforescencia durante un período de tiempo más largo.

Luminescencia en microscopía 

Para la microscopía, la fluorescencia es el tipo más útil de luminiscencia. Los fluorocromos pueden excitarse fácilmente con su longitud de onda específica a través de fuentes de luz específicas (por ejemplo, lámparas y sistemas de filtro o láseres) y la luz emitida puede distinguirse de la luz de excitación por la longitud de onda (cambio de Stokes). Usando imágenes de fluorescencia, el experimentador puede caracterizar la cantidad y la localización de una molécula dentro de una célula. Otra ventaja de la microscopía de fluorescencia es que se pueden usar varios fluorocromos simultáneamente. Los fluorocromos sólo tienen que variar en su longitud de onda de excitación y emisión. Por lo tanto, se pueden observar simultáneamente diferentes moléculas diana, permitiendo una gran variedad de experimentos, p. Estudios de colocalización, que deben realizarse.