Una de las características principales de un microscopio digital es la rapidez y facilidad con que permite la creación de modelos superficiales de estructuras macroscópicas y microscópicas. En una evaluación cualitativa, estos proporcionan una mejor comprensión y una documentación más detallada de la muestra. Además, la cuantificación de la superficie proporciona información valiosa sobre la composición de la superficie y su desgaste. ¿Qué especímenes son adecuados para su uso con un microscopio digital Leica y cuáles son las limitaciones del método utilizado?

La imagen tridimensional de los microscopios digitales Leica se basa en el principio de la variación del foco. La profundidad de campo limitada de la óptica se utiliza para determinar la información de profundidad para la muestra. El movimiento vertical del espécimen en relación con el objetivo determina la información del foco junto con la distancia a la óptica. Para cada posición vertical, el área de la imagen que está en enfoque nítido está separada del área borrosa, y ambas son procesadas por el software para crear un modelo de superficie. Una de las ventajas de este método es que además de la información de altura, la textura de la muestra también está documentada. ¿Qué factores influyentes son determinantes para la creación exitosa de un modelo de superficie 3D y cómo influyen estas variables en la resolución lateral y vertical?

Óptica

En microscopía, la profundidad de campo es en muchos casos una métrica empírica. En la práctica, las correlaciones entre la apertura numérica, la resolución y la ampliación determinan este parámetro. Con sus opciones de ajuste, los microscopios actuales crean un equilibrio entre la profundidad de campo y la resolución que es óptima para la impresión visual – dos parámetros que en teoría están inversamente correlacionados.

En las normas DIN / ISO, la profundidad de campo del lado del espécimen se define como la «profundidad axial del espacio en ambos lados del plano del espécimen en el que el espécimen se puede mover sin pérdida detectable de nitidez en el enfoque de la imagen, mientras que las posiciones Del plano de la imagen y el objetivo. «Sin embargo, la norma no da ninguna pista sobre cómo medir el umbral de detección del deterioro del enfoque. Particularmente a bajas ampliaciones, la profundidad de campo puede aumentarse significativamente deteniéndose, es decir reduciendo la abertura numérica. Esto se hace generalmente usando el diafragma de la abertura o un diafragma que esté en un plano conjugado al diafragma de la abertura. Sin embargo, cuanto menor sea la apertura numérica, menor será la resolución lateral. Por lo tanto, se trata de encontrar el balance óptimo de resolución y profundidad de campo dependiendo de la estructura de la muestra.

Textura de la muestra 

La textura de la superficie del espécimen abarca todas sus características y características. Estos incluyen las características de color y brillo de la superficie. Como se ha descrito anteriormente, el principio de la variación del enfoque se basa en el enfoque metódico. Cuanto mejor el espécimen se puede dividir en áreas agudas y fuera de foco, mejores serán los resultados del modelo de superficie. Este método es particularmente adecuado para texturas que tienen un buen contraste. Como en muchas áreas de aplicación de la microscopía, la iluminación se da un estado especialmente importante, ya que con frecuencia determina el éxito o fracaso. Seleccionar una iluminación adecuada permite documentar incluso un espécimen con poca textura. Por ejemplo, puede seleccionar una iluminación incidente oblicua que hace visibles incluso las estructuras ocultas.

Resolución mecánica en dirección vertical 

El tercer factor que influye en esta ecuación es la resolución mecánica en la dirección vertical. Este término significa los pasos posibles más pequeños en la dirección z del accionamiento de enfoque, que usualmente es motorizado. Para aprovechar al máximo la capacidad de rendimiento de la óptica, el paso más pequeño posible debe ser menor que la profundidad de campo actualmente utilizada, ya que de lo contrario se pierden datos de imagen. Un accionamiento de enfoque motorizado con una resolución de 10 μm, por ejemplo, es adecuado a una profundidad de campo de 15 μm. Las resoluciones laterales y verticales que son posibles con un sistema Leica DVM dependen de varios factores de influencia, como la estructura de la superficie o el iluminador, y por lo tanto deben determinarse en función de la aplicación. La interpolación alcanza una resolución vertical de la mitad de la profundidad de campo aplicada. La resolución lateral se determina por la apertura numérica de la ampliación utilizada.

Profundidad de campo – la fórmula de Berek

El autor de la primera publicación sobre el tema de la profundidad de campo visualmente percibida fue Max Berek, que publicó los resultados de sus extensos experimentos ya en 1927. La fórmula de Berek da valores prácticos para la profundidad visual de campo y por lo tanto todavía se utiliza hoy en día. En forma simplificada, es como sigue:

TVIS: Profundidad de campo visualmente percibida

N: Índice de refracción del medio en el que se encuentra el espécimen. Si la muestra es movida, el índice de refracción del medio que forma la distancia de trabajo cambiante se introduce en la ecuación

.Λ: Longitud de onda de la luz utilizada; Para luz blanca, lambda = 0,55 μmNA: Apertura numérica del espécimen

MTOT VIS: Ampliación visual total del microscopio

Si en la ecuación anterior reemplazamos la magnificación visual total con la relación de la ampliación útil (MTOT VIS = 500 a 1.000 NA), se hace evidente que en una primera aproximación, la profundidad de campo es inversamente proporcional al cuadrado de La apertura numérica.

Iluminación 

La selección de la iluminación adecuada es fundamental para el éxito del examen. El diseño modular de los microscopios digitales Leica le permite combinar la óptica seleccionada con la iluminación óptima para la aplicación. Existen los siguientes métodos para elegir:

Iluminación incidente variable oblicua 

Este método cambia la dirección de la iluminación de vertical a lateral. Este enfoque es particularmente adecuado para visualizar rasguños o pequeños rebajos.

Difusor Para superficies brillantes, el rango dinámico de la cámara es insuficiente en muchos casos y muchas áreas de la muestra están sobreexpuestas. Un difusor proporciona una reducción fiable del área sobreexpuesta.

Iluminador coaxial

Un iluminador coaxial se utiliza para superficies muy brillantes o reflectantes, como obleas o secciones metálicas.

Luz polarizada

La luz polarizada se utiliza para suprimir reflejos o para la documentación de materiales plásticos.

Iluminador coaxial con luz dirigida

Aquí, la luz dirigida crea una impresión tridimensional de la muestra. Esto es útil en muchos casos para determinar la superficie con mayor precisión.