Al operar un microscopio confocal, o al discutir características y parámetros de un dispositivo de este tipo, se menciona ineludiblemente el agujero de alfiler y su diámetro. Este breve documento introductorio pretende explicar la importancia del agujero de alfiler para aquellos que no querían dedicar demasiado tiempo a profundizar en la teoría y los detalles de la microscopía confocal, pero querían tener una idea sobre el efecto del agujero de alfiler.

Qué es un agujero de alfiler?

Los instrumentos ópticos basados ​​en lentes se ocupan principalmente de dos parámetros: la curvatura de la lente y el diámetro. La curvatura define en qué direcciones los rayos paralelos son desviados, el diámetro define la cantidad de esos rayos que contribuyen a la imagen resultante. El diámetro podría ser simplemente el marco de la lente, en muchos casos es un diafragma separado que delimita el diámetro de la viga. Los diafragmas comunes están hechos de láminas mediante las cuales se controla el diámetro del diafragma. Sin embargo, los diafragmas muy pequeños no encajan con la tecnología actual de laminillas. La manera más simple de generar un diafragma muy pequeño es, pinchar un cartón o una hoja de aluminio con una aguja (perno), por lo tanto, se llama un agujero de alfiler. Tales pinholes son el principio de trabajo de una «camera obscura» [1]

¿Cuál es el propósito del agujero en un microscopio confocal?

Los microscopios confocales permiten separar ópticamente las rebanadas de la respuesta de la muestra y grabarlas como imágenes. De manera óptima, las rebanadas cubren sólo la profundidad de foco generada en el microscopio.

Para lograr esta tarea, la muestra es escaneada por un pequeño punto de luz. La forma más pequeña que se puede generar es un punto limitado de difracción. Un punto limitado de difracción en el plano focal del microscopio es la imagen de una fuente de luz en forma de punto y por lo tanto llamada «función de propagación de puntos, psf». El psf es la distribución de la luz en el foco de un dispositivo óptico al imaginar un punto adimensional. Como todas las fuentes de luz convencionales no suelen tener forma de punto sino que tienen una extensión significativa, la fuente de luz se proyecta en una abertura diminuta, el agujero de alfiler, que actúa como una fuente en forma de mancha.

En el lado de detección, el sensor debe seguir de igual manera. Es decir, la región de detección debe ser también un punto limitado de difracción, coincidente en todo momento con el punto de iluminación. Esto se logra mediante una disposición similar: la luz de emisión es alimentada a través de una abertura minúscula, el agujero de alfiler de detección, antes registrado por un elemento de detección. Es este agujero de la detección, que se refiere generalmente cuando mencionamos el «agujero de alfiler» en un microscopio confocal.

El término «confocal» se refiere a la exactitud de esta disposición: tanto la iluminación y la detección se centran en el mismo lugar [2]. Los focos coinciden. La imagen entonces se genera escaneando el campo de visión spotwise, como el haz de electrones en una tv-pantalla del siglo pasado. La exploración se realiza usualmente mediante una disposición de espejos pivotables. Como se ilustra en la Figura 1 [3], el agujero de alfiler de detección elimina todas las emisiones que no se originan desde el plano focal. Por lo tanto, también se conoce como «filtro espacial», filtrando la profundidad de enfoque y bloqueando la señal extrafocal. A medida que el dispositivo corta secciones de la muestra por medios ópticos, también se denomina «cuchilla óptica».

¿Por qué es variable el diámetro del agujero de alfiler? Para la imagen confocal general, la recomendación es simplemente transmitir la parte interna de la característica de difracción limitada por el agujero de alfiler. Esta parte interior se llama el «disco Airy». El tamaño del disco Airy en la imagen intermedia depende de la longitud de onda (color), de la apertura numérica NA, de la ampliación de la lente objetivo y de la ampliación de la óptica interna del microscopio. La NA y la ampliación del objetivo están grabadas en el cilindro de la lente. En consecuencia, el diámetro del agujero de alfiler requerido es diferente para diferentes colores y para diferentes lentes objetivas que tienen diferentes NA y / o aumento.

Además, un agujero de alfiler variable ofrece al usuario la libertad de aumentar la nitidez de la sección óptica reduciendo el diámetro o reduciendo el rendimiento de corte óptico aumentando el diámetro. ¿Qué sucede, si el agujero de alfiler es más grande? Como se indicó anteriormente, el agujero de alfiler para la imagen confocal general debe pasar el disco de Airy. El diámetro en este caso se conoce como «Airy Unit, AU». Este es un compromiso bueno y práctico, no una ley por naturaleza. Cuando el agujero de alfiler se incrementa, más y más contribuciones extrafocales llegarán al sensor y cada vez más niebla la información focal aguda [4]. La intensidad global está aumentando y aparentemente la relación señal / ruido (SNR) parece mejorar. Sin embargo, el aumento se debe a la recopilación de señales borrosas no deseadas de capas fuera del plano focal. Si el agujero de alfiler es (virtualmente) infinito, el microscopio se comporta como un microscopio de campo ancho no confocal (ver Figura 3). Por lo tanto, por lo general, no se recomienda abrir el agujero de alfiler sólo para el beneficio de reducir el ruido de la imagen.

La resolución lateral no se ve afectada y se mantiene siempre en el valor que también es válido para la imagen de campo ancho y dado por la fórmula de Abbe: d = λ / 2NA (Ver Figura 4). ¿Qué sucede si el agujero de alfiler es más pequeño? Las rebanadas ópticas más finas, en el límite de difracción en dirección axial, se obtienen cuando el diámetro del orificio adopta cero. Esto, por supuesto, no es práctico. De hecho, el grosor de la rebanada en el límite de difracción es sólo un 25% mejor [4] que en 1 UA. Con excepción de los diámetros de agujeros por encima de 1 AU, también la resolución lateral se ve afectada cuando el agujero de alfiler está cerrado. En el pinhole cero, se puede esperar un aumento en la resolución lateral4 de ca. 30%. Esta mejora puede ser parcialmente explotada cerrando el agujero de alfiler un poco por debajo de la 1 UA recomendada. Por ejemplo a 0,6 UA, ya ganamos el 58% del incremento de resolución posible. Para asegurar una buena relación señal / ruido, debemos utilizar un microscopio con muy buena eficiencia para la fluorescencia emitida y sensores prácticamente libres de ruido.

Cómo se relaciona esto con pequeñas fracciones de psfs en escaneado de imágenes? Una alternativa para cerrar el agujero de alfiler para aumentar la resolución lateral es un método, llamado «rescanning de imagen» [5]. Aquí, el patrón de difracción en sí es escaneado de nuevo y las fracciones son redistribuidas a píxeles vecinos (vea la Figura 2, lado derecho). Mediante el cálculo de una nueva imagen sintética, la resolución lateral se puede aumentar aproximadamente un factor de 1,4 veces en comparación con la microscopía de campo ancho, casi independiente del diámetro equivalente del agujero de alfiler. Sin embargo, el rendimiento de corte óptico asumirá el rendimiento de corte óptico de toda la zona escaneada y seguirá las relaciones mostradas en la Figura 3.