Las secciones gruesas del tejido fino de la imagen así como los de animales enteros desempeña un papel creciente en la investigación de las ciencias de la vida. Obtener información espacial en áreas de tejidos profundos es crucial para entender completamente los procesos biológicos. Sin embargo, la calidad de la imagen disminuye la profundidad de la imagen en el tejido, ya que la luz se dispersa por los especímenes biológicos. Los métodos actuales permiten que la luz alcance aproximadamente cien micras de profundidad con fluorescencia confocal o de campo ancho estándar usando fuentes de excitación en el rango visible. Desafortunadamente, se hace imposible penetrar cientos de micras en el tejido mientras se usa luz visible. Debido a que la dispersión de la luz depende de la longitud de onda, se puede lograr una mejor penetración del tejido usando longitudes de onda de excitación más largas. Aquí es donde la excitación con luz infrarroja, los procesos de dos fotones y el OPO (oscilador de parámetros ópticos) puede mejorar drásticamente la calidad de la imagen.
¿Cómo obtenemos longitudes de onda de excitación más largas?
Primero, necesitas fuentes láser en rojo e infrarrojo. Normalmente, estas fuentes, llamadas láseres de Ti: Sa (titanio-zafiro), comienzan con longitudes de onda rojas, por ejemplo, 680 nm, y varían en el infrarrojo, por ejemplo, 1.080 nm. En segundo lugar, se necesitan dos fotones para alcanzar el colorante fluorescente aproximadamente al mismo tiempo. Entonces los dos fotones de, por ejemplo, 1.000 nm, juntos igualan la energía de una longitud de onda de excitación de aproximadamente 500 nm. Este proceso se llama multiphoton o imagenología de dos fotones.
Cuando la longitud de onda máxima del láser IR es de 1.080 nm, la excitación más larga alcanzable en este proceso de dos fotones equivale aproximadamente a 540 nm. Sin embargo, muchas etiquetas y tintes utilizados en la investigación biológica necesitan excitarse a longitudes de onda más largas y no pueden utilizarse para formación de imágenes de dos fotones, a menos que se utilice una longitud de onda de excitación superior a 1.080 nm. Con un oscilador paramétrico óptico, o OPO, ahora puede utilizar longitudes de onda de excitación de hasta 1.300 nm en el proceso de formación de imágenes de dos fotones. Esto permite colorantes emocionantes con un máximo de excitación en la microscopía estándar de un fotón de hasta aproximadamente 650 nm, lo cual es una gran mejora en la formación de imágenes confocal. Cuantos más colorantes sean posibles y alcanzables con el proceso de dos fotones, más información se obtendrá de especímenes con grandes profundidades de formación de imágenes.
¿Cuáles son las aplicaciones para OPO?
Si nos fijamos en las neurociencias, hay un campo llamado conexión, que está relacionado con las conexiones entre las neuronas, o entre las células en general. Para obtener una hoja de ruta de las conexiones entre las células que necesita tanto una visión general y una resolución detallada. El objetivo es comprender la función del tejido – para ver cómo funcionan los circuitos. Muchas otras áreas de investigación pueden beneficiarse de la OPO. Por ejemplo, en la biología del desarrollo es crucial proteger el tejido del fotodamado durante la imagen intravital del embrión, así como la penetración profunda de los tejidos altamente dispersantes. Aquí, las longitudes de onda de excitación más largas generadas por la OPO son óptimas. Adicionalmente, el OPO es útil para el uso de colorantes rojo y rojo lejano para la formación de imágenes multifotón. Incluso la excitación simultánea de dos colorantes a dos longitudes de onda diferentes es posible con el OPO.
¿Cómo funciona un OPO?
Es importante notar que una OPO utiliza la óptica no lineal, que la física subyacente no es fácil de explicar. Sin embargo, piense en los fotones individuales de un láser de bombeo, que dejan la fuente de IR. En un resonador óptico y un cristal anon-lineal, los fotones de la bomba se superponen y producen una señal y un rodillo intermedio. Esas tres ondas, la bomba, la señal y el intermedio, interactúan en el cristal no lineal. La señal – que es lo que quiere – gana poder con cada viaje de ida y vuelta en el resonador. Esto se denomina amplificación paramétrica de la señal, y la bomba pierde potencia en consecuencia. La señal se acopla entonces y se utiliza para la formación de imágenes por infrarrojos.
Cortesía de Evelyne Beerling, Jacco van Rheenen, Instituto Hubrecht, Utrecht, Países Bajos – Leica Microsystems.
*OPO (oscilador de parámetro óptico)
