La microscopía de fluorescencia es una forma especial de microscopía óptica. Utiliza la capacidad de los fluorocromos para emitir luz después de ser excitado con luz de una determinada longitud de onda. Las proteínas de interés se pueden marcar con tales fluorocromos mediante tinción de anticuerpos o marcado con proteínas fluorescentes. Permite determinar la distribución de una sola molécula, su cantidad y su localización dentro de una célula. Además, se pueden llevar a cabo estudios de colocalización y de interacción, observándose concentraciones iónicas usando colorantes que se unen de forma reversible, p. Ca2 + y fura-2, y se observan procesos celulares como endocitosis y exocitosis. Hoy en día incluso es posible imaginar partículas de sub-resolución con la ayuda de la microscopía de fluorescencia.

El cambio de Stokes

Un rasgo importante de la fluorescencia es el cambio de Stokes. Describe las diferencias en el nivel de energía de un fotón excitante y emitido. El fotón emitido por un fluorocromo es de mayor longitud de onda que un fotón excitante. Esto es debido a la liberación de energía a los alrededores después de que el fluorocromo se excita, pero antes de que emita el fotón. El cambio resultante en la longitud de onda hace posible distinguir entre la excitación y la luz de la emisión. La absorción y emisión de energía pueden ser vistas como características específicas de una especie de molécula.

Un microscopio de fluorescencia

Un microscopio de fluorescencia (vertical o invertido) es similar a un microscopio de luz ordinario, excepto que la iluminación es proporcionada por un láser como luz monocromática o una fuente de luz brillante y potente como un vapor de mercurio o una lámpara de arco de xenón. Además contiene un filtro de excitación y un filtro de emisión. El filtro de excitación transmite sólo la luz que es capaz de excitar la muestra con su colorante particular. La luz emitida por la muestra tiene que pasar a través del filtro de emisión antes de que llegue al detector. El filtro de emisión es sólo translúcido para la luz con una longitud de onda distinta, como la luz emitida por la muestra.

En los últimos años, los LED (diodos emisores de luz) también se han utilizado como fuente de luz para microscopios de fluorescencia. La longitud de onda de la luz emitida por los LED depende del material utilizado para la producción. Sin embargo, un filtro de excitación es necesario en la mayoría de los casos, ya que los LED a menudo emiten luz en un amplio rango de longitudes de onda.

La mayoría de los microscopios de fluorescencia son microscopios de epi-fluorescencia. El iluminador y la lente de objetivo están situados en el mismo lado de la muestra y la luz no pasa a través de la muestra. Además de la excitación y el filtro de emisión, se necesita un espejo dicroico para este tipo de microscopio de fluorescencia. Un espejo dicroico permite que la luz de una determinada longitud de onda pase a través, mientras que la luz de otras longitudes de onda se refleja. Los filtros y el espejo dicroico a menudo se conectan juntos en un cubo de filtro de una determinada longitud de onda pase a través, mientras que la luz de otras longitudes de onda se refleja. Los filtros y el espejo dicroico a menudo se conectan juntos en un cubo de filtro.

La luz de excitación pasa a través del filtro de excitación y se dirige al espejo dicroico. Esto refleja la luz a través del objetivo hacia el espécimen. Los fluorocromos de la muestra son excitados y emiten fotones. Esta luz de emisión pasa de nuevo a través del objetivo al espejo dicroico. La luz emitida tiene una longitud de onda apropiada y es capaz de pasar. La luz de excitación que es reflejada por la muestra no puede pasar a través del espejo dicroico y será bloqueada. Si la luz de excitación es capaz de atravesar el espejo dicroico, se bloqueará cuando alcance el filtro de emisión. La luz que pasa a través del filtro de emisión se puede medir con un detector. Se utilizan diferentes tipos de filtros en microscopía de fluorescencia. Se pueden distinguir los filtros de paso de banda, paso largo y paso corto. Los filtros de paso de banda transmiten una banda de longitudes de onda, mientras que la luz con una longitud de onda mayor o menor será bloqueada. Los filtros paso largo y paso corto son filtros de borde. Los filtros de paso largo transmiten luz de longitudes de onda largas. La luz con una longitud de onda por encima de cierto valor de corte no podrá pasar. Por el contrario, los filtros de paso corto transmiten longitudes de onda cortas y bloquean los largos.

Diferentes técnicas en microscopía de fluorescencia

La microscopía de fluorescencia es ampliamente utilizada y ofrece gran especificidad. Diversas técnicas permiten abordar diferentes problemas e incluso eludir el límite de difracción descrito por Ernst Abbe.

La localización de una especie de molécula puede determinarse con una co-tinción de organelas, p. el citoesqueleto o las membranas. La microscopia confocal de barrido láser (CLSM) permite observar áreas en la muestra sin señales desde el exterior del plano focal y permite el corte óptico. La microscopia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica que permite observar una región delgada cerca de la superficie celular. Un campo evanescente excita los fluorocromos en esta área.

Una técnica para observar la dinámica de una especie de molécula es la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Los fluorocromos en una zona restringida son fotoblanqueados y se puede medir la difusión de moléculas no blanqueadas en esta área. Los estudios de interacción pueden realizarse con microscopía de transferencia de energía de fluorescencia (FRET). Un cromóforo donante excitado puede transferir energía a un fluorocromo aceptor y excitarlo. Esto sólo es posible si ambos se unen muy de cerca. Si estos tintes están acoplados a diferentes proteínas, sólo podrán transferir energía y fluorescencia si las proteínas interactúan entre sí.

Las técnicas que permiten imágenes de sub-resolución son la microscopia de agotamiento de la emisión (STED), la microscopia de agotamiento del estado fundamental (GSD), la microscopía de una sola molécula y el agotamiento del estado terrestre seguido por el retorno individual de moléculas (GSDIM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) microscopía de reconstrucción óptica (STORM). Los microscopios de la sub-resolución usados ​​para estas técnicas también se refieren como nanoscopes, pues resuelven imágenes en la escala del nanómetro.