En algún momento de su carrera de investigación y ciencia, sin duda se ha encontrado o se encontrará con el microscopio de fluorescencia. Esta técnica omnipresente ha transformado la forma en que los microscopistas pueden crear imágenes, marcar y rastrear cualquier cosa, desde organismos completos hasta proteínas individuales y más.
En este artículo, examinaremos qué se entiende por «fluorescencia», la historia y la física básica detrás de su definición, el descubrimiento y la aplicación de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) y un vistazo al campo de las sondas fluorescentes, que incluye Quantum Dots.
¿Cómo definimos «fluorescencia»? Al escribir la frase «definición de fluorescencia» en cualquier motor de búsqueda, obtendrá la siguiente frase, o algo muy similar; «La emisión de radiación visible o invisible de ciertas sustancias como resultado de la radiación incidente de una longitud de onda más corta, como los rayos X o la luz ultravioleta».
¿Cómo se relaciona esta definición con la microscopía de fluorescencia (Figura 1)? La «radiación incidente de una longitud de onda más corta» es simplemente la fuente de luz utilizada para «excitar» los fluoróforos en una muestra. Esta luz puede incluir el espectro visible, ultravioleta (UV) e infrarrojo (IR) y la fuente en un microscopio puede variar desde una lámpara de arco de mercurio o xenón hasta láseres. Los fluoróforos («ciertas sustancias» en la definición anterior) son compuestos químicos que tienen propiedades especiales por las cuales pueden reemitir luz / fotones de longitud de onda mayor con la excitación por luz que tiene una longitud de onda inferior.
La unidad básica de longitud de onda es el medidor y la «longitud de onda» se define como la distancia entre dos picos o valles sucesivos de una onda de luz. El símbolo para la longitud de onda es la letra griega lambda (l). Las longitudes de onda que se usan típicamente en microscopía están en el rango nanométrico (nm) dentro del espectro visible entre 400 y 700 nm, el espectro UV debajo de 400 nm y el espectro IR que comienza a 700 nm (Figura 2).
Los fluoróforos se clasifican por su longitud de onda de excitación y emisión, que generalmente se presenta en forma de un gráfico que muestra los picos máximos. Los fluoróforos son naturalmente estables en lo que se denomina el «estado fundamental». Cuando absorben un fotón de luz (de la luz de «longitud de onda más corta»), la energía del fotón eleva los electrones del fluoróforo a un estado de «excitación» de energía superior. Los electrones excitados no permanecen en este estado, pero pierden la energía vibratoria y emiten un fotón de una longitud de onda más larga en su retorno al estado fundamental.
Para los fluoróforos usados en microscopía, un ciclo completo desde la excitación hasta el retorno a tierra toma en la región de 0.5 a 20 nanosegundos. Las longitudes de onda de excitación y emisión de fluoróforos se abrevian comúnmente como la letra griega lambda con un subíndice «ex» (excitación) o «em» (emisión; lex o lem).
Cada fluoróforo tiene un espectro de excitación y emisión máximo distinto y esta propiedad se usa para distinguir diferentes objetivos en el mismo espécimen de interés. Por ejemplo, usando la tinción fluorescente DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole) para resaltar las proteínas nucleares en una célula junto con la faloidina marcada fluorescentemente para resaltar el citoesqueleto de actina.
El diagrama de Jablonski de fluorescencia
El físico polaco Profesor Aleksander Jablonski (1898-1980) fue el primero en describir el ciclo entre el suelo / excitación / emisión en un diagrama de energía de tres niveles que se conoce simplemente como un «Diagrama de Jablonski». En 1930, recibió su doctorado de la Universidad de Varsovia por su tesis titulada «Sobre la influencia del cambio de la longitud de onda de la luz de excitación en los espectros de fluorescencia». Fue en 1933 que publicó su artículo («Eficiencia de la fluorescencia anti-stokes en tintes») en Nature que contenía el diagrama de Jablonski. Esta simple pero efectiva ilustración del comportamiento de los fluoróforos resalta la excitación desde el estado fundamental al estado excitado y de regreso al suelo con la emisión de un fotón de longitud de onda más larga (Figura 3).
Aunque la Figura 3 es un diagrama de Jablonski simplificado, se debe tener en cuenta que los fluoróforos pueden existir en muchos estados diferentes de excitación y emisión. Además, los fluoróforos pueden volver a la tierra a través de estados variables de relajación conocidos como «estados de triplete», dependiendo de la rotación electrónica de las moléculas.
El cambio de Stokes
Sir George Gabriel Stokes (1819-1903) fue un matemático y físico irlandés, y durante su vida realizó muchos descubrimientos y avances en el campo de la óptica y la luz. Fue nombrado Catedrático Lucasiano de Matemáticas en Pembroke College, Cambridge en 1849 y permaneció en este puesto hasta su muerte en 1903. Escribió un artículo maravillosamente descriptivo que se publicó en 1852 y se llamó
«Sobre el cambio de refrangibilidad de la luz» [1 ] El lenguaje utilizado en este texto es diferente al que estamos acostumbrados en la literatura científica moderna. Aquí hay dos breves extractos del lenguaje maravilloso que Stokes usó; «Hacia el final del otoño pasado, cuando la tardanza de la temporada ofrecía pocas oportunidades de observación, aprendí de diferentes fuentes que el tipo de cristal amarillo que ya se ha mencionado como poseedor en un grado tan alto de la propiedad de la dispersión interna era coloreado con óxido de uranio «.
Y: «Fue ciertamente curioso ver el tubo iluminado instantáneamente cuando se sumergió en los rayos invisibles: era visible literalmente la oscuridad. En conjunto, el fenómeno tenía una apariencia sobrenatural».
El «cambio de Stokes» fue nombrado más tarde en su honor. Cuando los electrones excitados regresan al estado fundamental y emiten un fotón de luz, la longitud de onda siempre es más larga que la que se utilizó para excitar el fluoróforo. Esto se debe a la propiedad de la luz por la cual la longitud de onda es inversamente proporcional a la energía de la radiación. El Stokes Shift describe la diferencia (en nanómetros) entre la excitación del pico y la longitud de onda de emisión máxima de un fluoróforo (Figura 4).
Distinguir entre la excitación y la emisión de un fluoróforo es proporcionalmente más fácil con un aumento en el cambio de Stokes. Los fluoróforos poseen características únicas en términos de su Stokes Shift, que se debe a su configuración electrónica y estructura molecular. El descubrimiento y el uso de la proteína verde fluorescente Fue Stokes quien utilizó por primera vez el término «fluorescencia» para describir sus fenómenos observados, pero la historia se remonta a 1565. Un médico y botánico español llamado Nicolas Monardes describió un extraño color azul de una infusión de madera de un árbol mexicano, Lignum nephriticum. A pesar de estas primeras observaciones, unos 400 años más tarde aparecería una sustancia verde fluorescente en un organismo vivo. En 1955 Davenport y Nicol publicaron un artículo [2] que describe el tejido fotogénico en los eosinófilos de una subclase de medusas conocida como Hydromedusae. En ese momento, los autores de este trabajo no se dieron cuenta de que los eosinófilos contenían una proteína verde fluorescente (GFP).
No fue hasta 1962 que Osamu Shimomura (* 1928) publicó un artículo [3] en el que el componente fotogénico era reconocido como una proteína. Trabajando con su profesor (Frank Johnson) en la Universidad de Princeton, recolectaron muestras de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria. Tenían una forma única de aislar las proteínas fluorescentes de las medusas, es decir, exprimir el tejido bioluminiscente aislado a través de una bolsa de algodón para producir una solución que Shimomura llamó «exprimidores».
En 1994, Martin Chalfie (* 1947) profesor de la Universidad de Columbia, compiló un documento que demuestra que el gen que codifica GFP podría expresarse funcionalmente en células procariotas y eucariotas (concretamente Escherichia coli y las neuronas de Caenorhabditis elegans) [4]. El documento afirma que «debido a que los sustratos y cofactores exógenos no son necesarios para esta fluorescencia, la expresión de GFP se puede utilizar para controlar la expresión génica y la localización de proteínas en organismos vivos». Fue esta publicación la que allanó el camino para el uso extensivo de GFP en la investigación biológica.
Un año más tarde, el profesor Roger Tsien (1952-2016) de la Universidad de California, San Diego (que había estado investigando mutantes de la GFP de tipo salvaje) publicó su trabajo en la correspondencia científica en Nature [5]. Este descubrimiento de una mutación de punto único (S65T) fue elegido por Tsien y sus colegas ya que tenía las longitudes de onda de excitación y emisión más largas (490/510 nm) lo que lo hacía más fotoestable y daba como resultado los bien conocidos picos de excitación / emisión de GFP.
En 2008, Shimomura, Tsien y Chalfie recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química por sus funciones y el descubrimiento de GFP. Cuando Shimomura dio su conferencia Nobel, dijo que «cuando encontré el cromóforo de GFP en 1979, pensé que había hecho todo lo que podía hacer con GFP, y decidí terminar mi trabajo en GFP con el fin de concentrar mis esfuerzos en el estudio de bioluminiscencia «. Continuó admitiendo que «GFP era una proteína hermosa pero permaneció inútil durante los siguientes 30 años después del descubrimiento».
Desde los descubrimientos de Tsien, su laboratorio ha diseñado muchas variantes de GFP que cubren gran parte del espectro visible y, de hecho, han revolucionado el campo de la microscopía óptica y la imagenología. Gracias a dicha ingeniería genética, GFP está disponible en colores que van desde la parte azul del espectro (EBFP, 380/460 nm) hasta la parte amarilla del espectro (YFP; 514/527 nm).
Reporteros y sondeos
Además del campo de las imágenes, los fluoróforos pueden usarse como «informadores» para estudiar la expresión génica en células y organismos. La enzima luciferasa, así como el gen que codifica la GFP, se encuentran entre los que se usan comúnmente para examinar si las células expresan genes específicos. Los organismos o células se transfectan con ADN vírico genéticamente modificado o plásmidos que emiten fluorescencia cuando se expresa el gen diana. Los orgánulos o sitios de interés dentro de las células se pueden visualizar y examinar en las células transfectadas.
Los anticuerpos que están marcados (o «etiquetados») con fluoróforos se denominan comúnmente «sondas fluorescentes». Antes del uso generalizado de GFP y los otros fluoróforos que siguieron a su descubrimiento, dos de los fluoróforos más comúnmente utilizados para marcar anticuerpos fueron FITC (isotiocianato de fluoresceína) y TRITC (isotiocianato de tetrametilo rodamina). Aunque todavía se usan FITC y TRITC, ha habido avances importantes en el campo y la elección de fluoróforos y sondas es extensa por decir lo menos.
Ciertamente, uno de los rangos más extensos de fluoróforos utilizados hoy en día en los laboratorios es el de los tintes «Alexa Fluor». El rango actual de tintes Alexa Fluor disponibles abarca el espectro visible con longitudes de onda de excitación que van desde 346 a 784 nm.
Puntos cuánticos
Quantum Dots (o «Qdots») fueron descubiertos por primera vez en una matriz de vidrio en 1981 por el científico ruso Alexey Ekimov mientras trabajaba en el Instituto Óptico Estatal Vavilov en San Petersburgo. Sin embargo, las primeras soluciones coloidales de Qdots fueron descubiertas por Louis Brus, que estaba trabajando en semiconductores en los laboratorios Bell de AT & T en Nueva Jersey. Ahora es profesor de Química en la Universidad de Columbia. En dos artículos publicados en 1983 y 1984, Brus describió Qdots como «cristalitos semiconductores pequeños».
Los puntos cuánticos se comportan de manera peculiar, aunque contienen entre 100 y 100.000 átomos, exhiben propiedades como si estuvieran formados por un solo átomo. Sin embargo, se ajustan a las propiedades de un fluoróforo por el cual pueden absorber la energía de la luz, excitarse y liberar fotones de luz cuando regresan al estado fundamental. Pero la longitud de onda de la luz que emiten depende del tamaño del Qdot: cuanto menor es el Qdot, más corta es la longitud de onda de emisión. Esta propiedad se debe a Qdots más pequeños que poseen un «espacio de banda mínimo» más grande. Esta es la cantidad de energía que se requiere para excitar un electrón a un estado de energía superior. Como los Qdots más pequeños requieren más energía para la excitación, posteriormente emiten longitudes de onda de luz más bajas (la longitud de onda es inversamente proporcional a la energía de excitación).
Fue casi 20 años más tarde, en 2002, cuando Qdots comenzó a estar disponible comercialmente para los investigadores de ciencias de la vida de Quantum Dot Corporation, California.
Los puntos cuánticos son herramientas muy brillantes y estables para su uso en aplicaciones de fluorescencia. Los estudios han demostrado que los Qdots son varios órdenes de magnitud más brillantes que los fluoróforos convencionales, aunque existe alguna variación en cuanto a qué tan brillantes son en comparación con los colorantes orgánicos [6]. En términos de fotoestabilidad, se ha informado que los Qdots son hasta 100 veces más estables que los fluoróforos convencionales y en un estudio de imagen in vivo, permanecieron fluorescentes durante hasta cuatro meses [7].
En las sondas fluorescentes convencionales, uno o más fluoróforos se pueden unir a un solo anticuerpo de interés. Sin embargo, debido al área superficial muy grande de Qdots, muchas moléculas y anticuerpos pueden unirse a un único punto que puede tener muchas ventajas, incluida la amplificación de señal fluorescente. El uso de Qdots también ofrece una ventaja en los ensayos múltiplex en los que se pueden obtener imágenes de una variedad de longitudes de onda simultáneamente. En tales ensayos, la única variable es el tamaño (y por lo tanto la longitud de onda de emisión) de Qdot que es seleccionado por el investigador. La excitación de una amplia gama de Qdots se puede realizar simultáneamente con la luz blanca que niega el uso de láseres múltiples y muchos ajustes para formar la imagen final.
Fuente:
Referencias
- On the change of refrangibility of light; G. G. Stokes, M. A., F. R. S. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1852 142, 463-562, published 1 January 1852; http://rstl.royalsocietypublishing.org/content/142/463.full.pdf+html
- Luminescence in Hydromedusae D. Davenport; J. A. C. Nicol, Published 29 November 1955. DOI: 10.1098/rspb.1955.0066; http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/144/916/399
- Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 1962 Jun;59:223-39.; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13911999?dopt=Abstract
- Green fluorescent protein as a marker for gene expression; Science 11 Feb 1994: Vol. 263, Issue 5148, pp. 802-805 DOI: 10.1126/science.8303295; http://www.sciencemag.org/content/263/5148/802?ijkey=e60d69b507876bb025397e40e06389c288d2e92e&keytype2=tf_ipsecsha
